تبلیغات
سایت تخصصی علوم دامی ایران
  • تازه ترین مطالب:
آخرین مطالب
تولید برون تنی رویان

تولید برون تنی رویان

مقدمه

تخمدان­ها از زمان تولد شمار فراوانی اووسیت دارند که به شکل فولیکول­های تخمدانی هستند. بسیاری از این فولیکول­ها، پس روی می کنند و تنها شمار اندکی از آنها به گامه تخمک ریزی می­رسند و می­توانند به نوزاد تبدیل شوند. بنابراین نرخ پیشرفت ژنتیکی در گونه­هایی که در هر چرخه تخمدانی یک تخمک ریزی می کنند و طول آبستنی آن­ها نیز زیاد است (مانند گاو) سریع نخواهد بود. برای نمونه هر ماده گاو در طول عمر خود کمتر از 5 گوساله تولید می­کند و روش­هایی که بتوانند شمار گوساله­های هر ماده گاو را افزایش دهند تأثیر شایان توجهی بر بهره ژنتیکی خواهند گذاشت.

ازدیاد شمارنوزاد حیوان ماده به دو روش صورت می­گیرد:

1)                 انتقال رویان

2)                 تولید برون تنی رویان  (IVEP)

انتقال رویان

 در این روش با تحریک تخمدان و افزایش شمارتخمک ریزی و پس از جفت گیری و تشکیل زایگوت، رویان­های بسیار جوان از دستگاه تولید مثل چنین ماده­ای (که به آن، رویان دهنده گفته می­شود)  بیرون آورده می­شود (رویان گیری) و به چندین حیوان ماده دیگر (که به آن­ها رویان گیرنده گفته می­شود) انتقال داده می­شود که نرخ تولید مثلی رویان دهنده را افزایش می­دهد و سبب افزایش پیشرفت ژنتیکی می­شود. به شیوه افزایش شمار تخمک­ ریزی، سوپراوولاسیون می‌گویند. به روش بیرون آوردن رویان­ها و انتقال آن­ها به ماده­های دیگر، انتقال رویان گفته می­شود.

تولید برون تنی رویان

در این روش، اووسیت­هایی که تخمدان­ها از زمان تولد در داخل خود دارند از تخمدان­ها بیرون آورده می­شوند (به جای اینکه با تحریک هورمونی و افزایش شمار تخمک ریزی لقاح یابند و رویان­های تولید شده از رحم بیرون آورده شوند) سپس در محیط آزمایشگاه تلقیح مصنوعی صورت می­گیرد و رویان تولید می­شود ودر نهایت رویان به داخل رحم حیوان ماده انتقال داده می­شود. با این روش می­توان شمار شایان توجهی اووسیت را پی در پی از تخمدان­ها برگرفت و به ویژه امکان تولید رویان از دام­های بسیار جوان نیز وجود خواهد داشت. همچنین با این روش می­توان به بررسی آبستن شدن و پیامدهای آن پرداخت. برای نمونه، گاوهایی که پس از سه یا چهار بار تلقیح یا بیشتر، آبستن می­شوند و گاوهایی که ناهنجاری­های رشد و تکامل اووسیت دارند. این روش به ویژه برای ساختن موجودات ترانس ژنیک کاربرد دارد.

مراحل مختلف تولید برون تنی رویان

تولید برون تنی رویان (IVEP) شامل پنج مرحله ­اصلی می­باشد:

1)      اووسیت گیری

2)      ) بلوغ برون تنی اووسیت

3)      لقاح برون تنی اووسیت

4)      کاپاسیته شدن برون تنی اسپرم

5)      رشد برون تنی رویان

اووسیت گیری

در آزمایش­های آغازین برای تولید برون تنی رویان، اووسیت­ها را از تخمدان­ها بیرون می­آورند که به دو روش صورت می گیرد:

1)                 از تخمدان دام­های کشتار شده

2)                 از تخمدان دام­های زنده

اووسیت­گیری از تخمدان دام­های کشتار شده

در این روش، اووسیت­ها را از تخمدان­های دام­های کشتار شده بیرون می­آورند (استخراج اووسیت از فولیکول) که به این روش آسپیره کردن اووسیت می­گویند.

اووسیت­گیری از دام­های زنده

برای انجام این کار در دام زنده، لوله­های سوزنی شکل درازی به کار برده می­شوند که پمپ خلأ متصل هستند. تخمدان به کمک دستگاه اولتراسوند (دستگاه سونوگرافی) نمایان می­شود و سوزن، بعد از فرستادن به درون واژن از دیواره واژن گذرانده شده و به سوی تخمدان هدایت می­شود. آنگاه سوزن به درون یک فولیکول فرو برده می­شود و محتویات فولیکول (مایع فولیکولی و اووسیت) تخلیه می­شوند. بعد از آن، سوزن از فولیکول بیرون آورده می­شود و فولیکول­های دیگر تخلیه می­شوند. این روش اووسیت گیری را ترانس واژینال می­گویند.

بلوغ برون تنی اووسیت (IVM)

اووسیت­های نشخوارکنندگان معمولا در 39 درجه سانتی گراد و در یک محیط مرطوب دارای 5 درصد گاز کربن دی اکسید بالغ می­شوند. زمان بهینه بلوغ (در بیشتر از 90 درصد اووسیت­هایی که در مرحله متافازII هستند) 24-22 ساعت است. تنها علامت نمایان از بلوغ اووسیت در طول IVM، گسترش سلول­های کیومولوس می­باشد. به خاطر محتوای لیپیدی بالای سیتوپلاسم اووسیت، هسته در طول کشت نمی­تواند بلوغ خود را کامل کند. حضور سلول­های کیومولوس که اووسیت را می­پوشانند در طول این مرحله مورد نیاز می­باشند. این سلولها اسید هیالورونیک تولید می­کنند که در ماتریکس برون سلولی به صورت پلیمردر می­آید و فضای درون سلولی افزایش می­یابد و زمینه برای بلوغ هسته فراهم می­شود.

کاپاسیته شدن برون تنی اسپرم

از آنجا که اسپرم باید کاپاسیته شود تا بتواند با اووسیت لقاح یابد، بنابراین برای لقاح برون تنی اووسیت باید اسپرم را نیز کاپاسیته کرد. در آزمایش­های آغازین برای بررسی امکان لقاح برون تنی اووسیت، اسپرم­های کاپاسیته شده، پس از جفت گیری نر با یک ماده از رحم و یا اویدکت ماده جمع آوری می­شدند. سال­ها گذشت تا پژوهش گران توانستند کاپاسیته شدن برون تنی اسپرم دام­ها را با موفقیت انجام دهند. ساز و کار و طول زمان مورد نیاز کاپاسیته شدن برون تنی در گونه­های مختلف، متفاوت است. روش­های گوناگونی برای کاپاسیته شدن برون تنی اسپرم وجود دارد:

v               اینکوباسیون در محیط های کشت دارای غلظت بالای یونی یا ایونوفورهای کلسیم و یا کافئین

v               اینکوباسیون برای 18 تا 24 ساعت در محیط کشت

v               اینکوباسیون در pH بالا

لقاح برون تنی اووسیت ( IVF)

برای انجام لقاح، 25 میکرولیتر سوسپاسیون اسپرم و 25 میکرولیتر مایع دارای هپارین (10 میکروگرم در میلی لیتر) آمیخته می­شوند. محیط لقاح (50 میکرولیتر) به زیر پارافین منتقل می­شود و 4 یا 5 اووسیت به آن افزوده می­شود. اینکوباسیون در دمای 39 درجه سانتی گراد و هوای مرطوب دارای 5 درصد گاز کربن دی اکسید برای 24 ساعت انجام خواهد شد. محلول­های نمکی متعادل مانند Krebs-Ringer برای انجام لقاح برون تنی مناسب هستند. افزودن آلبومین و یا سرم خون سبب می­شود که واکنش آکروزوم بهتر انجام شود. به این محلول­های نمکی، گلوکز یا پیرووات نیز افزوده می­شود که منبع انرژی برای اسپرم و اووسیت هستند.

برخی از معیارهایی که نشان می­دهند اووسیت لقاح یافته است:

v               وارد شدن اسپرم به سیتوپلاسم اووسیت

v               متورم شدن سر اسپر و تشکیل پرونوکلیوس

v               انجام کلیواژ (تقسیم سلولی) و تشکیل شدن بلاستوسیست

v               تجزیه شدن دانه­های کورتیکال درون سیتوپلاسم اووسیت

v               وجود دم اسپرم در سیتوپلاسم اووسیت

دیگر روش­های لقاح اووسیت

یکی از روش­های لقاح اووسیت، قرار دادن یک یا چند اسپرم در زیر زوناپلوسیدا است که به آن سابزونال اسپرم اینسرشن می­گویند. زمانی که شمار اسپرم­ها زیاد باشد، احتمال پلی اسپرمی افزایش می­یابد و اگر شمار آنها کم باشد، نرخ لقاح کاهش می­یابد.

همچنین می­توان یک اسپرم را درون سیتوپلاسم (اووپلاسم) تزریق کرد، روشی که به نام انتراسیتوپلاسمیک اسپرم اینجکشن شناخته می­شود. این روش در سال­های اخیر به ویژه برای درمان برخی مشکلات لقاح در انسان به کار برده شده است که عامل آن­ها ناهنجاری­های تولید مثلی در مرد هستند.

رشد برون تنی رویان (IVD)

در شرایط استاندارد کشت سلولی، رشد رویان نشخوارکنندگان در مرحله 16-8 سلولی متوقف می­شود اما با تغییر دادن محیط کشت این مشکل نیز برطرف شد و هم اکنون می توان زایگوت چندین گونه را تا گامه بلاستوسیست پرورش داد.

پرورش زایگوت تا رسیدن به گامه بلاستوسیت با چندین روش امکان پذیر است:

v               انتقال زایگوت­ها به اویدکت خرگوش یا گوسفند و بیرون آوردن آنها پس از 4 یا 5 روز. هنگام انتقال بخش پایینی اویدکت نزدیک به رحم، با نخ جراحی بسته می­شود تا رویان­ها به رحم نرسند.

v               پرورش زایگوت در محیط کشتی مانند TCM-199 که دارای سلول­های گرانولوزا و یا سلول­های پوششی اویدکت باشد.

v               پرورش در محیط­های کشت ساده، بدون سلول­های سوماتیک مانند مایع اویدکت مصنوعی

از ویژگی­های اویدکت این است که می­تواند برای پرورش رویان گونه­های مختلف به کار رود.



 سه شنبه 20 آبان 1393  01:06 ق.ظ    افشین سیفی جمادی